千年桐半木质化春梢扦插繁殖及生根机理研究(2)

2）生长性状的调查。扦插35 d 后统计愈伤率，63 d 后统计生根率，根长大于1 mm 视为生根[14]，测定一级不定根最长根长、一级不定根平均根长、一级不定根数量、根系干质量。下文中的最长根长、平均根长和生根数皆是指一级不定根。将根系置于60 ℃恒温箱中烘至根系质量不变，称其干质量，精度为0.01 g。计算根系效果指数=(平均根长×根系数量)/插穗总数；根系生长指标隶属函数为R(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，X为各处理中指标测定值，Xmin和Xmax为某一指标在所有处理中的最小值和最大值，对各处理生根效果进行综合评价[12]。

3）生理指标的测定。扦插0、21、42、63 d后截取插穗基部不定根及长约2 cm 的韧皮组织，液氮对样品速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于分析内源激素含量和POD、SOD 活性。每次取样15 株，以安捷伦1260 高效液相色谱仪串联6420A 质谱仪测定植物内源激素生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷（ZR）含量。激素提取：准确称取样品约0.5 g，加入10 倍体积乙腈溶液，4 ℃提取之后过夜，12 000g离心5 min，取上清液，沉淀再次加入5 倍体积乙腈溶液，提取2 次，合并所得上清液，加入25 mg C18 填料，剧烈震荡30 s，10 000g离心5 min，取上清，氮气吹干，以200 μL 甲醇复溶，过0.22 μm 有机相滤膜，放入-20 ℃冰箱待上机检测。电离方式：ESI 负离子模式；扫描类型：MRM；气帘气：15 psi；喷雾电压：-3 500 V；雾化气压力：65 psi；辅助气压力：70 psi；雾化温度： 400 ℃；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 反相色谱柱（2.1×150，3.5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：A:B=(水/0.1%甲酸）：（甲醇），外标法定量；采用建成生物试剂盒法测定SOD、POD 的活性。

1.5 数据处理及分析

采用SPSS 20.0 和Excel 2016 等软件对数据进行统计及方差分析，对有显著性差异的指标进行Duncan’s 多重比较。

2 结果与分析

2.1 千年桐扦插生根过程形态和解剖结构观察

2.1.1 插穗生根形态观察

对插穗生根过程进行拍照观察，综合不同处理抽样调查情况，将插穗生根过程分为4 个阶段：1）0 ～14 d，切口逐渐愈合，基部产生愈伤组织，顶部萌生新芽（图l a）；2）15 ～34 d，基部愈伤组织增多，新生芽继续生长（图1 b）；3）35 ～42 d，开始产生不定根，生根类型有皮部生根型（图1 c）和愈伤组织生根型（图l d），新生顶芽及叶片产生光合作用；4）扦插43 d 以后，不定根快速生长，根系不断伸长增粗（图1 e）。千年桐以皮部生根为主，而且不同处理下插穗生长状态存在明显差异（图1 f、图1 g）。扦插75 d后开始进行炼苗移栽（图1 h）。

2.1.2 插穗生成过程解剖结构观察

对扦插0 d 千年桐插穗解剖结构进行显微观察，发现其表皮（Ep）位于茎段横切面最外层，具有细胞间隙大、排列疏松等特点，皮层（Co）则是由数层排列不规则的薄壁细胞组成，维管组织从里到外组成依次是髓（Pi）、木质部（Xy）、维管形成层（Vc）和韧皮部（Ph），对多个样本进行切片观察，均未发现潜伏存在的根原基和已分化的根原始细胞（图2a）。

图1 千年桐插穗根系生长变化特征及生根类型Fig.1 The alterant character on the root growth process and the rooting types ofVernicia montana

对不同时期插穗解剖结构进行显微观察，发现其生根大致经历4 个阶段，植物生长调节剂诱导分化根原始细胞、根原始细胞形成根原基（Rp）、根原基发育形成不定根（Ar）和不定根的伸长，与上述对生根形态拍照观察结果相对应。1）扦插14 d，在韧皮部和维管形成层部位发现了刚刚开始分裂的根原始细胞，但此时形成层细胞刚刚恢复分生能力，周围组织生长分化并不明显（图2 b）；2）扦插21 d，薄壁细胞出现了明显的分裂分化，并开始向外产生类分生组织，进一步分裂形成排列紧密与周围细胞有明显区别的细胞团，即形成了根原基（图2 c）；3）扦插35 d，根原基细胞团通过快速地平周分裂和垂周分裂等，其形态发生了巨大变化，由开始的卵圆形变为楔形，并朝着皮部不断延伸（图2 d）；4）扦插42 d，根原基继续朝着韧皮部射线的方向生长，延伸到皮层区域，此时根原基可以区分出根冠（Rc）、根尖（Rt）和分生区，最外层表皮被不定根所突破（图2 e）。不定根继续生长到56 d 时，根冠区域逐渐分化出维管组织，与插穗的维管系统相连形成完整的根结构（图2 f）。图2 g 和图2 h 分别为生长35和42 d插穗基部切片，可以发现由愈伤组织（Ca）分化产生的根原基较少。

文章来源：《解剖学研究》 网址: http://www.jpxyjzz.cn/qikandaodu/2021/0414/449.html